绿原酸（CGA）是由咖啡酸和L-奎尼酸形成的酯，具有广泛生物活性，例如抗糖尿病、神经保护等作用，已有研究报道CGA可有效抑制肿瘤生长，这在许多临床前模型和胶质瘤患者的II期临床试验中得到了证实。然而，其直接蛋白靶点和相关抗癌机制仍然未知。2024年7月6日，中国医学科学院药物研究所胡海宇、陈晓光团队在Acta Pharm Sin B（IF=14.7）发表题为“Target fishing and mechanistic insights of the natural anticancer drug candidate chlorogenic acid”的研究文章，开发光亲和探针PAL-CGA揭示了ACAT1是绿原酸（CGA）的关键靶点，并证明CGA通过阻断ACAT1的Y407磷酸化来抑制癌症增殖，凸显了其在癌症治疗中的临床潜力。

1、新型光亲和标记CGA探针 PAL/CGA的设计和合成

研究者基于文献对CGA 类似物的SAR研究，推断奎宁酸上的羧酸部分可以在不丧失CGA活性的情况下进行修饰，由于标记分子量较大的生物素可能会显著影响探针的活性和细胞通透性，因此采用了生物正交方法，设计合成了光亲和标记CGA类似物PAL/CGA，并使用1H NMR，13C NMR和HRMS表征探针PAL/CGA的结构（图1）。

图1 CGA和PAL/CGA的结构

2、ABPP筛选PAL/CGA的蛋白靶标

首先通过细胞实验发现CGA降低人黑色素瘤 A375 细胞增殖，探针PAL/CGA与CGA的抗癌活性一致，表明添加双功能标签不会明显干扰母体药物活性。进一步作者分离了A375肿瘤组织的线粒体，通过ABPP方法确定CGA的特定蛋白质靶点，鉴定并确认其中一种捕获的蛋白质是线粒体ACAT1（线粒体乙酰辅酶A乙酰转移酶1）。酶活实验显示CGA对ACAT1的抑制作用比阳性对照AH（ACAT1抑制剂）的更强（图2）。

图2 ABPP筛选PAL/CGA的蛋白靶标

3、CGA与ACAT1相互作用的验证

通过SPR、ITC、热位移分析（TSA）和药物亲和力响应靶标稳定性（DARTS）验证了CGA和ACAT1之间的亲和力和结合动力学。与阳性对AH相比，CGA在较低浓度下更有效地保护 ACAT1 蛋白水解（图3）。

图3 体外验证CGA与ACAT1相互作用

随后通过2种细胞系评估了细胞裂解物和活细胞中的ACAT1-CGA相互作用，与上述使用纯化重组ACAT1结果一致，DARTS测定表明CGA有效保护ACAT1蛋白免于在A375和NCI-H1299细胞裂解物中发生剂量依赖性降解。此外，使用CGA荧光探针发现ACAT1敲低细胞系中CGA荧光强度显著降低，证明了ACAT1是CGA结合蛋白（图4）。

图4 体内鉴定ACAT1为CGA结合蛋白

4、CGA与ACAT1的低温电子显微镜（EM）结构

先前的研究表明ACAT1的共价抑制剂AH可与ACAT1四聚体结合并将其破坏为单体，从而使酪氨酸激酶无法磷酸化和稳定激活ACAT1。为了阐明CGA的抑制机制作者采用低温电子显微镜（cryo-EM）来研究 ACAT1/CGA 复合物的结构。结果显示与共价抑制剂AH相反，与CGA孵育时对四聚体和单体ACAT1蛋白之间的平衡没有影响，这表明ACAT1的活性抑制可能是由于四聚体的广泛构象变化，而不是将ACAT1四聚体破坏成单体。为了证实CGA直接靶向ACAT1 α螺旋腔中的Ala 401残基，作者将Ala（A）替换为Phe（F），发现可以阻止CGA与ACAT1的结合，使用ITC分析也证实CGA无法与突变蛋白结合（图5）。

图5 CGA与ACAT1的低温电子显微镜（EM）结构

6、CGA对ACAT1功能的影响

代谢失调是癌症的标志之一，而ACAT1是肿瘤发生的重要代谢调节剂。有研究报道上调的致癌酪氨酸激酶使ACAT1的Y407磷酸化并稳定其活性四聚体形式，进而抑制丙酮酸脱氢酶（PDH）活性，促进糖酵解，导致肿瘤生长。因此，抑制ACAT1活性会消除ACAT1对PDH的抑制作用并减少肿瘤生长。作者发现CGA 处理有效抑制了 A375 和NCI-H1299细胞系中的Y407 磷酸化，增加PDH 活性，此外，CGA处理不影响四聚体的形成，但降低了四聚体ACAT1的Y407磷酸化。这些结果表明，CGA对ACAT1的抑制可能是由于Y407磷酸化的中断，而不是将 ACAT1四聚体破坏为无活性的单体（图6）。

图6 CGA降低ACAT1四聚体Y407磷酸化

最后，利用异种移植裸鼠验证CGA作用机制，发现ACAT1敲低的异种移植瘤生长速度和重量显著降低，且接受CGA治疗的异种移植瘤生长减缓，但CGA治疗并不能进一步减少ACAT1敲低的异种移植瘤的体积和重量。此外，接受CGA治疗的异种移植小鼠肿瘤中的ACAT1活性显著降低（图7）。

图7 CGA降低Y407磷酸化抑制癌细胞增殖和肿瘤生长

总结

研究表明CGA是一种新型非共价ACAT1抑制剂，可有效结合ACAT1四聚体，消除Y407磷酸化，降低ACAT1活性，消除ACAT1对PDH的抑制作用，减弱癌细胞增殖和肿瘤生长（图8）。

图8 CGA阻断ACAT1的Y407磷酸化来抑制肿瘤增殖

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