多酚类物质有广泛的生物学效应，包括清除自由基、螯合金属离子、调节酶活性、改变信号传导通路等。绿原酸(CGA)是人类食物中含量最丰富的多酚类物质，已有动物实验证实其可以减少化学物质所诱导的肿瘤发生率，但其抗癌的分子机制尚不完全清楚。2008年7月-2010年1月，我们观察了CGA对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响，并探讨其机制。

1材料与方法

1．1材料CGA购自昆明元宝枫公司，4℃保存，实验时用无血清培养基配至工作浓度；羊抗人CyclinDl，鼠抗羊IgG—PE的抗体，同型对照抗体购自Becman公司；四甲基偶氮唑蓝(Ma r)、碘化丙啶(PI)购自美国Sigma公司。乳腺癌细胞MCF-7购自上海细胞库，人正常成纤维细胞为手术患者正常组织原代培养用含10％胎牛血清(Gibco)的MEM培养基(Gibco)，在5％CO：、37 oC饱和湿度条件下培养。

1．2 CGA干预及细胞增殖抑制率检测取对数生长期的成纤维细胞及乳腺癌细胞株MCF-7，调整浓度为l X 108／L，接种于96孔板中，每孔细胞数为lX 104个，接种24 h，细胞贴壁后换无血清培养液，作用24 h使细胞同步化，换用含血清的培养基，加入CGA使其终浓度分别为0．15、0．3、0．5、0．75、l mg／ml，同时设立空白对照组及阴性对照组(不加CGA)。每孑L体积为200斗l，每个浓度设5个复孔，分别培养24、48、72 h后，换培养基，每孔加入新鲜配制的ram'(10 g／1．)20止，继续培养4 h后，去除培养液，每孔加入200一DMSO溶解结晶10 min，用自

动酶标仪(Biorad酶标仪)于490 nm处测定吸光度值(A值)。细胞增殖抑制率=(1一加药组A值／对照组A值)X 100％，实验重复3次。

1．3 CGA干预及细胞凋亡率检测将对数生长期的NCF-7细胞消化后，调节细胞密度为l X 105／ml，接种于6孔板中。37℃、5％CO：条件下孵育24 h后换新培养液。将MCF-7细胞随机分为对照组(不含CGA)及CCA组，CCA组分别予CGA干预使终浓度分别为0．5、1 mg／ml，继续培养48 h。收集两组细胞，P13S洗涤2次后，P13S重悬，逐滴注入预冷

的70％乙醇中，固定24 h以上，1 000 r／rain离心5rain，去除乙醇，PBS清洗1次，离心弃P13S，加50pg／Inl P10．5 Illl(含lO斗g／rnl RNaseA)于避光处染色30 rain，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复3次。

1．4 CGA干预及细胞周期分析细胞培养分组及干预同1．3。收集两组细胞，PBS洗涤2次后，PBS重悬，逐滴注入预冷的70％乙醇中，固定24 h以上，1 000 r／rain离心5 rain，去除乙醇，PBS清洗1次，离心弃PBS，加50卜g／ml P1 0．5 IIll(含10斗g／rIlltlNase^,)于避光处染色30 min，用流式细胞仪检测细胞周期。实验重复3次。

1．5 CGA干预及Cyclin D1表达检测细胞培养分组及干预同1．3。收集两组细胞，PBS洗涤2次后，PBS重悬，逐滴注入预冷的70％乙醇中，固定24h以上，l 000 r／rain离心5 rain，去除乙醇，PBS清洗1次，离心弃PBS。加入破膜剂混匀共同孵育10rain后，加入羊抗人Cyclin D1 10出混匀共同孵育30 rain，PBS清洗一次，加入二抗鼠抗羊IgGl-PE，混

匀孵育30 rain后，以羊抗人IgGl为同型对照，行流式细胞仪检测。参考文献M1方法，检测过程中调节电压使同型对照的平均荧光值为20一30，以相同条件对样本进行检测，计数10 000个细胞，记录对照及样本的平均荧光值(MF)；Cyclin D1的表达用平均荧光强度比(MFIR)来进行分析。MFIR=样本MF／对照MF。

1．6统计学方法采用SPSS 16．0统计学软件，各药物浓度处理组与对照组的差异进行方差分析，P≤O．05为差异有统计学意义。

2结果

2．1 IVICF-7细胞增殖抑制率见图l。

2．2 MCF-7细胞凋亡率CCA作用48 h后细胞出现凋亡，CGAl rag／ml与0．5mg／rnl时的细胞凋亡率分别为24．47％±1．36％、10．30％±1．40％，对照组为8．10％±0．52％，P均<0．01。

2．3 MCF-7细胞周期CCA组0．25、0．5 mg／l：IllCCA作用48 h后，Go／G，期细胞数占细胞总数的百分比分别为57．75％±0．25％、60．30％±2．70％，对照组为45．20％±3．51％(F=29．830，P=0．001)。可见CCA具有细胞周期阻滞作用，可将MCF-7细胞阻滞于G。／G，期，从而抑制细胞继续分裂增殖。

2．4 Cyclin D1表达CGA组0、0．25、0．5 mg／rIllCCA作用48 h后，Cyclin D1的MFIR分别为9．64±0．18、9．15±0．22、8．10±0．28(F=34．332，P=0。001)。

3讨论

CGA广泛存在于咖啡、水果和蔬菜中。多项研究证实CGA可通过多种途径抑制肿瘤，包括抑制DNA甲基化¨¨；抑制NF—KB、AP．1及MAPK活化等；诱导肿瘤细胞凋亡是其抑制肿瘤的主要机制。本研究结果显示，1 rag／m1的CGA可诱导MCF-7细胞凋亡，与文献报道相符。

但本研究发现，0．5 mg／ml CCA作用48 h时，无明显诱导凋亡作用，但却有很强的细胞生长抑制率，与1 mg／ml时比较无统计学差异，提示CCA存在除凋亡外的其他途径抑制细胞增殖。细胞周期调控在细胞增殖、分化、凋亡过程中发挥重要作用。本研究发现CGA作用48 h后，MCF-7细胞G。／G。期细胞呈剂量依赖性增加，明显高于对照组，S期细胞

及G：／M期细胞虽有减少趋势，但各组问差异无统计学意义。可见CGA主要使MCF-7细胞阻滞于G。／G，期，具有调节Gl／S期节点的作用。

Cyclin D1是细胞周期调节蛋白，含量呈周期性变化，其过表达时可使细胞持续性增殖归]。本研究结果显示，随着CCA浓度升高，Cyclin DI表达降低。提示CCA可能通过下调Cyelin D1表达减少相关转录因子释放¨0。，从而导致MCF-7细胞的C。期阻滞。

    综上所述，CGA可抑制MCF-7细胞增殖，使细胞阻滞于Go／G。期，其机制可能与下调Cyclin DI的表达有关。但细胞内的信号网络纷繁复杂，本研究仅仅显示了一种可能的通路，其它信号途径尚有待研究；另外本研究为体外实验。关于CGA体内是否能产生相应的抗肿瘤作用，有待于进一步的研究证实。